Microscopia Eletrônica de Varredura
A principal função de qualquer microscópio é tornar visível ao olho humano o que for muito pequeno para tal. A forma mais antiga e usual é a lupa seguida do microscópio óptico, que ilumina o objeto com luz visível ou luz ultravioleta. O limite máximo de resolução dos microscópios ópticos é estabelecido pelos efeitos de difração devido ao comprimento de onda da radiação incidente. Os microscópios ópticos convencionais ficam,então, limitados a um aumento máximo de 2000 vezes, porque acima deste valor, detalhes menores são imperceptíveis.
Para aumentar a resolução pode-se utilizar uma radiação com comprimento de onda menor que a luz visível como fonte de iluminação do objeto. Além disso, a profundidade de campo é inversamente proporcional aos aumentos, sendo necessário, então, um polimento perfeito da superfície a ser observada, o que às vezes é incompatível com a observação desejada.
O microscópio eletrônico de varredura (MEV) é um equipamento capaz de produzir imagens de alta ampliação (até 300.000 x) e resolução. As imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter virtual, pois o que é visualizado no monitor do aparelho é a transcodificação da energia emitida pelos elétrons, ao contrário da radiação de luz a qual estamos habitualmente acostumados.
O princípio de funcionamento do MEV consiste na emissão de feixes de elétrons por um filamento capilar de tungstênio (eletrodo negativo), mediante a aplicação de uma diferença de potencial que pode variar de 0,5 a 30 KV. Essa variação de voltagem permite a variação da aceleração dos elétrons, e também provoca o aquecimento do filamento. A parte positiva em relação ao filamento do microscópio (eletrodo positivo) atrai fortemente os elétrons gerados, resultando numa aceleração em direção ao eletrodo positivo. A correção do percurso dos feixes é realizada pelas lentes condensadoras que alinham os feixes em direção à abertura da objetiva. A objetiva ajusta o foco dos feixes de elétrons antes dos elétrons atingirem a amostra analisada. Este parelho pode fornecer rapidamente informações sobre a morfologia e identificação de elementos químicos de uma amostra sólida. Sua utilização é comum em biologia, odontologia, farmácia, engenharia, química, metalurgia, física,medicina e geologia.
Outra característica importante do MEV é a aparência tridimensional da imagem das amostras, resultado direto da grande profundidade de campo. Permite, também, o exame em pequenos aumentos e com grande profundidade de foco, o que é extremamente útil, pois a imagem eletrônica complementa a informação dada pela imagem óptica.
A imagem formada a partir do sinal captado na varredura eletrônica de uma
superfície pode apresentar diferentes características, uma vez que a imagem resulta da amplificação de um sinal obtido de uma interação entre o feixe eletrônico e o material.
figura 1 :Fotógrafos Bruce Wetzel/Harry Schaefer Instituto Nacional do Câncer
MICROSCOPIA DE LUZ
Desde a invenção do microscópio por volta de 1590, houve uma ampliação dos conhecimentos de biologia básica, pesquisa biomédica, diagnósticos médicos e ciência dos materiais. Os microscópios de luz podem ampliar objetos em até 1000 vezes e revelar detalhes mínimos. A tecnologia da microscopia de luz evoluiu muito desde os microscópios de Robert Hooke e Antoni van Leeuwenhoek. Técnicas especiais e ópticas foram desenvolvidas para revelar as estruturas e a bioquímica da vida nas células. Os microscópios entraram na era digital usando dispositivos acoplados de carga acoplada (CCDs) e câmeras digitais para capturar imagens. Apesar disso, os princípios básicos dos modelos mais avançados são muito parecidos com os dos microscópios mais simples usados nas aulas de biologia.
No microscópio de luz, as preparações coradas são examinadas por iluminação que atravessa o espécime. O microscópio é composto por partes mecânicas e ópticas. O componente óptico tem três lentes: condensadora, objetivas e oculares. O condensador concentra a luz de uma lâmpada e projeta um feixe luminoso sobre o espécime. A objetiva recebe a luz que atravessou o espécime e projeta uma imagem aumentada do objeto em direção a ocular, que novamente amplia a imagem e a projeta na retina, em uma tela, em uma câmera fotográfica ou em um detector eletrônico. No caso das imagens projetadas na retina, a ampliação total é calculada multiplicando-se o aumento da objetiva pelo aumento da ocular.
Figura 2. Granuloma laríngeo. Em a e em b observa-se intenso infiltrado de células inflamatórias na lâmina própria bem como proliferação de pequenos vasos (Microscopia de luz, HE- a-40X; b-80X).
O Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)
O MET possui sistemas de iluminação e vácuo que produz feixes de elétrons de alta energia (energia cinética), que ao incidir sobre uma amostra de tecido ultrafina (na espessura de nanométro*), fornece imagens planas, imensamente ampliadas, possuindo a capacidade de aumento útil de até um milhão de vezes e assim permitindo a visibilização de moléculas orgânicas, como o DNA, RNA, algumas proteínas, etc. O sistema de vácuo remove o ar e outras moléculas de gás da coluna do microscópio, evitando assim que ocorra erosão do filamento e propiciando a formação de uma imagem com excelente qualidade e contraste. A imagem é projetada em um anteparo fluorescente, que poderá ser redirecionada para uma chapa fotográfica para registro, ou ainda a imagem pode ser captada por um sistema computadorizado de captação de imagens e armazenada em CD-Rom para futura análise.
Grande parte dos átomos das estruturas celulares tem baixo número atômico e muito pouco contribui para a formação da imagem. O emprego de substâncias que contêm átomos pesados, como ósmio, chumbo e urânio permitem obter um contraste entre as estruturas celulares, contribuindo para uma melhor imagem. Então, por fim, a imagem é também uma resultante da absorção diferenciada de elétrons por diversas regiões da amostra, seja por variação de espessura, seja por interação com átomos de maior ou menor número atômico.
Figura 4. Superfície epitelial do granuloma laríngeo com alargamento das junções intercelulares, alterando a estrutura dos desmossomos (Microscopia eletrônica de transmissão, 1.550X).
Principal aplicabilidade:
Análises morfológicas, caracterização de precipitados e determinação de parâmetros de rede.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 11ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008
